摘要

　　液相層析串聯質譜儀分析技術近年來發展迅速，在製藥、醫學、生物技術、環境分析、材料等領域皆有廣泛性之運用，芳香烴毒化物是工業上最常使用及造成污染的化合物種類，其所造成的污水或地下水，一般需經過繁複的前處理步驟後才能以氣相層析儀或氣相層析質譜儀分析，本研究嘗試以含芳香烴類毒化物污染水溶液經簡單過濾後直接以液相層析串聯質譜儀進行分析。研究結果酚、 TNT 、 RDX 等芳香族化合物可有效檢出並進行定量，研究過程發現 Capillary 電壓、 Cone 電壓及 Gas Flow 是三種影響離子化的重要條件，其最佳化的分析條件為 Capillary =3.0kV 、 Cone=40V 、 Gas Flow= 500L /hr ，在定量分析部份，選擇離子掃瞄（ selected ion recording, SIR ）及多重反應監測掃描（ multiple reaction monitoring, MRM ）模式皆可有效執行定量分析， SIR 及 MRM 偵測極限可達到 2.12μg/L 及 20.32μg/L 。証明此方法具有很好離子辨識度、偵測極限及定量分析能力，可滿足毒化物分析、環境汙染檢測及地下水污染檢測之需求。

關鍵詞：液相層析串聯質譜儀，酚，芳香烴，火炸藥。

1. 前言

　　芳香族化合物是苯以及化學性質類似苯的化合物，一般此類化合物都有相當好的穩定性 [1] ，其在工業上使用非常廣泛，以最基本的苯為例，我國 2006 年生產、製造、儲存及使用量即超過 289 萬公噸，芳香族化合物如此被大量使用，且很多都屬毒性化學物質，在國土安全防衛上，造成嚴重威脅，本研究即以酚為例，利用液相層析串聯質譜儀檢測水中芳香族化合物含量，除可執行定性分析外，更可藉其高精密之定量分析能力，精準檢測環境中污染濃度或所造成地下水之污染情形，可提供緊急應變及國土復育之參考依據，此技術也可進一步運用於協助國軍部隊靶場芳香族火炸葯污染監測，為本研究之目的。

　　酚為一個氫氧基直接接於苯環的芳香有機化合物，其危害性分類為第 6.1 類毒性物質，為略常酸性及刺激味的化合物。水污染防治法在事業、污水下水道系統及建築物污水處理設施之放流水標準，其限值為 1.0 m g/L[2] 。在工業與日常生活中應用非常廣泛，可作為消毒藥劑、樹脂、染料、香料、殺菌劑、除草劑等用途。由於這些污染物安定且會累積在生物體內，其毒性高，有致癌性，殘留在環境中的時間很長，會破壞生態及人體健康 [3-4] ，目前行政院環境保護署環境檢驗所公告水中酚類檢測方法包含比色法 NIEA W 520.51A 、氣相層析儀／火焰離子化偵測器及電子捕捉偵測器法 NIEA W522.50T 、水中半揮發性有機化合物檢測方法－氣相層析質譜儀法 NIEA W801.50B[5] ，其大部分為氣相層析法，氣相層析能作精確定性分析，定量分析則可能受前處理影響，回收率較差，進而影響分析結果，在氣相層析質譜法中，前處理需要以二氯甲烷萃取，萃取液經去水、減壓或 K-D 濃縮及定量，經繁複之前處理過程後，才能以氣相層析質譜儀分析，在添加半揮發性有機物標準品於試劑水之精密度與準確度測試中，顯示酚的平均回收率僅有 45.3 ﹪氣相層析質譜儀法 [5] 。利用液相層析串聯質譜儀則可直接以水樣直接進行分析，可簡化前處理複雜程序、增加分析效率、減少萃取溶劑體積及可直接進行副產物分析等優點。

　　自從 1912 年 [6] 發展出 第一套質譜儀以來，隨著科 技的進步，質譜的游離方法及分析技術 有了長足的進步，目前質譜儀被應用於分析及鑑定未知化合物組成與結構的一項重要工具， 液相層析串聯質譜儀是結合液相層析儀及質譜儀的分析技術，近年來因為科技的進步才有突破性之發展 。一開始的質譜游離方式以電子撞擊法 (Electron Impact Ionization EI)[7] 和化學游離法 (Chemical Ionization CI)[8] 為主，兩種方式須將分析物氣化，因而不適於不具揮發性及熱不穩定的物質，且分析物分子量範圍有限。接著在 1970 年代，脫附游離法的發展，可以提升了分析物分子量，並成為生命科學研究的工具。到了 1980 年代中期，游離技術有重大發現： Fenn[9] 等人發展出電噴灑游離法 (Electrospray Ionization ESI) 及德國 HillenKamp[10] 等人發展出基質輔助雷射脫附游離法 (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization MALDI) ，能分析大分子量的分子及高分子聚合物之分子離子訊號，其中大分子經電噴灑游離後會產生多價電荷的分析物離子，此游離方式也易於連接各式層析介面，因此具有多方應用，目前已用於製藥、醫學、生物技術、環境分析、材料等方面的研究 [11-12] 。

　　本研究儀器同時具有電噴灑游離法 ESI 及大氣壓力化學游離子法 APCI 兩種離子化法，其中 ESI 的離子產生機制主要分為三個步驟 : 生成帶電液滴、液滴的霧化及揮發霧化後之溶劑、產生氣相之帶電荷離子。一般電噴灑游離裝置如圖一所示，是由一小口徑毛細管進樣，外管以高壓氮氣產生霧化並外加一電壓使霧化液滴帶電，再經高溫氮氣將溶劑去除，溶劑去除同時因單位電荷增加而產生庫倫爆炸現象，進而使分子氣化並帶電荷，以利進入質譜儀進行分析 [11-12 、 20] 。

圖 1 :ESI 及 APCI 裝置圖 [20]

APCI 離子化法是在液滴噴灑後，再利用 Corona Discharge Pin （如圖 1 所示）施予一高電壓，讓液滴噴灑時，產生一種類似電子雲的現象，使氣化之分子帶電，此法能使不容易利用 ESI 帶電荷的分子，容易產生帶電荷的分子，若仍無法帶電，將無法通過 Sample Cone 的篩選，唯有分子帶電才能進入質譜分析 [11-12 、 20] 。

2. 實驗

2-1 藥品與試劑

1. 甲醇 (methanol) ： J.T.Baker LC/MS 級

2. 氰甲烷 (acetonitrile) ： J.T.Baker LC/MS 級

3. 酚 (phenol) ： J.T.Baker , A.C.S. 試藥級

4. 丙酮 (aceton) ： Mallinckrodt HPLC 級

5. RDX ：聯勤 203 廠

6. TNT ：聯勤 203 廠

2-2 儀器設備

本實驗所使用之儀器主要為液相層析串聯質譜儀，儀器型號及規格如下所示：

1. 超高效能液相層析儀 (UPLC) ：美商沃特斯，型號為 ACQUITY Binary Solvent Manger 、 ACQUITY Sample Manger 、 ACQUITY TUV Detector 。層析管柱 :ACQUITY UPLC BEH C8 1.7 μm 。

2. 串聯質譜儀 (MS/MS): 美商沃特斯 Waters Quattro Micro API MASS Spectrometer 離子模式分為 ESI 及 APCI 。

2-3 實驗步驟

2-3-1 儀器條件設定

1. 超高效能液相層析儀：

　　超高效能液相層析儀比一般液相層析儀有更高的操作壓力，可以連結管徑更細之分離管柱（ 1.7μm ），使分離效果及操作時間更佳，在標準品測試時 流動相以 0.3m L/min 甲醇進行流洗， UV 偵測波長設定為 270nm 。其他樣品測試時，流動相以 0.3 m L/min 甲醇 / 水 (50/50) UV 偵測波長設定為 254nm 。

2. 串聯質譜儀：

　　質譜儀參數設定區分兩大部分，一為離子化條件設定，另一為質譜分析條件設定，離子化條件可以針對待測物性質選定 ESI 或 APCI 不同離子源，依酚帶電特性選擇 ESI 負離子模式，而最常影響離子訊號結果的參數為 Capillary 電壓、 Cone 電壓及 Gas Flow 三種條件，一般分析條件如表 1 所示。質譜分析條件部分可以選擇 MS Scan 、 SIR （ selected ion recording ）、 MRM （ multiple reaction monitoring ）、 Parents 、 Daughter 、 Neutral loss 、 Survey 等模式，本研究所使用包含 MS Scan 、 SIR 、 MRM 三種模式， MS Scan 即是一般

表 1 :SIR 離子源設定條件

的質譜掃描，其掃描結果可得到 TIC 圖譜 [14] 及個別質譜圖，只要質譜分析條件調整適當，樣品經離子化後皆可被偵測器檢出，就可檢測出樣品中化合物種類及濃度，唯此種模式係全質譜掃描，除待分析物外，其它雜訊也易被檢出而影響定量結果，故可進一步以 SIR 及 MRM 兩種模式作精準定量分析， SIR 稱做選擇離子掃瞄，係針對特定離子做掃瞄偵測，故可得到較佳之解析度及偵測極限，定量分析上也可得到較佳分析結果，藉此可精準作定量分析，酚的 SIR 分析設定條件如表 2 所示。

表 2 : 酚之 SIR 分析設定條件

　　MRM 多重反應監測掃描模式則是將待測離子進一步給予能量利用氮氣進行撞擊，其進行步驟為 (1) 以第一段質譜選擇待測物之 m/z 值之範圍，即為前驅離子（ precursor ion ） (2) 選擇該離子進入第二段碰撞室進行氮氣碰撞解離（ collision-induced dissociation, CID ），找出前驅離子被氮氣擊碎後穩定的產物離子（ product ion ）， (3) 最後即可用前驅離子及產物離子配對的模式進行定量分析，此法可更精準定量，唯樣品經再度碰撞後離子訊號將減少，此模式偵測極限將較差 [15] 。以此法製作酚之檢量線，酚的 MRM 參數如表 3 所示。

表 3 : 酚之 MRM 分析設定條件

2-3-2 酚的檢量線配製

　　酚的檢量線配製，秤取所需的酚溶於甲醇中，濃度分別為 1000μg/L 、 800μgL 、 650μg/L 、 500μg/L 、 200μg/L 、 100μg/L 、 50μg/L 、 20μg/L 、 10μg/L 、 5μg/L 。所配置之樣品再經 0.22μm 過濾錠過濾，並密封於 1.5mL 樣品瓶中避免揮發。

2-3-3 芳香族火炸葯分析

1. 火炸葯樣品配製：配製 1mg/L TNT 、 RDX 等高能火炸藥水溶液，樣品經再經 0.22μm 過濾錠過濾之，並密封於 1.5mL 樣品瓶中。

2. 質譜儀部份選擇 ESI 負離子模式，離子化參數和偵測器參數依不同物質進行調整，其中 Capillary 電壓及 Cone 電壓為主要之變數。

3. 結果與討論

3-1 離子化條件最佳化

在實驗過程中離子訊號強弱會影響酚濃度的偵測，因此為了增加偵測極限，所以必須使離子訊號強度達到最佳化，而影響離子訊號最大三個變數為 Capillary 電壓、 Cone 電壓及 Gas Flow ，以這三個變數去尋求最佳條件。實驗結果如圖 2 及表 4 所示，在改變 Capillary 電壓參數時，電壓從 15kV 開始可得到訊號，隨著加大電壓，發現在 3.5kV 時其離子強度最大，當超過最高值後離子訊號迅速下降，顯示酚的帶電性變差；在 Cone 電壓測試中，在 35V 以下改變電壓對離子強度影響不大，在 40V 位置有最高值，其前後位置離子強度迅速下降，顯示樣品經霧化及帶電後，進入質譜儀之電壓須精準調整才能得到較佳訊號，在 Gas Flow 測試中，氮氣流量在 400~ 600L /hr 都有很好離子強度，顯示只要流量適中就可得到極佳離子強度，此三項因素仍需互相調整以獲得最佳條件，經實驗結果，主離子峰的離子訊號在 Capillary =3.0kV 、 Cone=40V 、 Gas Flow= 500L /hr 為質譜訊號最佳的操作條件。

圖 2 : 改變離子化參數對離子訊號的影響

表 4 : 離子化參數與離子訊號強弱表

　　進入質譜儀前，因連接管路會有時間延遲現象，造成圖 3 （ D ）發現 TIC 圖譜於 1.18 m in 離子有最強訊號，再觀察此訊號 m/z93 ，證明此為酚之訊號， 0.81m in 之訊號為溶劑之離子訊號，圖 3 （ C ）為 SIR 分析結果，因此模式係選擇性離子掃瞄，所以僅針對酚作掃描，故有很好之雜訊比，可得到極佳之 TIC 圖。圖 3 （ B ）為 MRM 分析結果，因此模式係針對酚進一步撞擊後與子離子比對，需同時符合母離子與子離子才會記錄於 TIC 圖中，離子訊號僅有 2.33e 4 ，與圖 3 （ C ）離子訊號 5.97e 6 及圖 3 （ D ）離子訊號 1.36e 7 相較，明顯差幾個等級。由圖 3 的 A 至 D 圖可知，樣品經分離及被 UV 偵測後，可立即在質譜儀辨識該分子之分子量，並可進一步利用二次質譜確認其結構，對於複雜基質樣品將可有效辨別其結構及濃度。

圖 3 : （ A ）酚的 UV 圖譜 (B) 酚的 MRM TIC 圖譜（ C ）酚的 SIR TIC 圖譜（ D ）酚的 MS TIC 圖譜

3-3 酚之檢量線分析

　　針對標準品酚的 m/z 93 以 SIR 進行檢量線分析 [16] ，實驗中配製 5μg/L 至 1000μg/L 等 10 個不同等級之濃度，以濃度為 X 軸， SIR 離子訊號為 Y 軸，作線性迴歸，得一方程式

Y=665X+11580 (1)

r=0.997 ， r 2 =0.994 ，如圖 4 及表 5 所示，此檢量線濃度包含低濃度至高濃度， r 2 =0.994 在可接受之範圍，其誤差百分比在 20% 範圍之內，顯示有極佳之定量分析能力 [15-16] 。進一步測試此方法偵測極限，可得到偵測極限為 2.12μg/L ，與水中半揮發性有機化合物檢測方法－氣相層析質譜儀方法偵測極限（ 5.75μg/L ）比較 [5] ，顯示偵測能力較佳。

　　定量方法的另一模式是採用 MS/MS 多種掃描模式中的 MRM 來定量分析物 [15] ，因此必須針對不同 Collision Energy

圖 4 : 酚 SIR 的檢量線及其誤差

表 5 : 不同濃度酚與離子訊號及其誤差表

取得最好的 MRM 數據，需使母離子及碎片離子同時存在，在 Collision Energy=20 V 時可以得到清楚之主離子訊號（ m/z 93 ）與碎片強度（ m/z 65 ），質譜圖如圖 5
所示。相同的以 5μg/L 至 1000m g/L 等 10 個

不同等級之濃度，利用 m/z 65 及 93 作多重選擇性離子掃瞄 以濃度為 X 軸，離子訊號為 Y 軸，作線性迴歸，得方程式

Y=0.612X-1.268 (2)

r=0.995 ， r 2 =0.990 ， 如圖 6 及表 5 所示，此檢量線濃度包含低濃度至高濃度， r 2 =0.990 在可接受之範圍，其誤差百分比在僅 50μg/L 較差，整體仍可接受，由於二次質譜造成樣品濃度的損失，顯示提高酚的辨識度之後，檢量線僅有些微影響，可以有效執行定量分析，進一步測試此方法偵測極限，可得到偵測極限為 20.32μg/L ，證明此方法雖可排除其他物之之干擾，但也犧牲部分偵測能力。 綜上所述，定量方法上，我們採用兩種模式，一為 SIR ，一為 MRM ，從實驗得知，其偵測極限各有不同， SIR 最低可偵測到 2.12 μg/L 而 MRM 只能測到 20.32 μg/L ， MRM 偵測指標性一向比 SIR 來的準確，相對地 MRM 篩選門檻高，所以偵測極限比 SIR 來的大，這兩種模式都可應用於定量標準品。 若以精準定量為目的，在樣品基質複雜時，於樣品濃度於可偵測範圍，可選擇 MRM 分析模式以避免干擾，若樣品基質單純則可選擇 SIR 分析模式，可得到較好的偵測結果。

圖 6 : 酚 MRM 的檢量線及其誤差

3-4 芳香族火炸葯分析

　　一個多重樣品由酚及火炸藥所組成，利用 UV 偵測器及質譜儀分別測得層析圖譜，如圖 7 所示。分析物經由層析管柱產生滯留，不同分析物有不同滯留時間，分析物個別流出再進入質譜儀，可以發現滯留時間於 2.57 min 時，可對應到 TNT 的 SIR 圖譜，進入質譜的延遲時間為 0.2 min ，相對地 RDX 在 UV 圖譜的滯留時間為 1.55min ，而在其 SIR 圖譜為 1.78 min ，顯示延遲時間相同，此滯留時間之分子結構可由圖 8 之質譜圖獲得證實。由圖 7 （ A ） UV 層析圖譜可發現，由於 UV 波長設定為 254 nm ，酚（ 270nm ）在 UV 圖譜之訊號較弱，所以沒明顯訊號。

　　在圖 8 （ B ） RDX 質譜圖，因 RDX 本身不容易帶電，故於流洗液中添加氯化銨，利用 RDX 與氯離子結合，使 RDX 易帶電，利用此技術再結合 ESI 及 APCI 功能，對於大部分之芳香烴毒化物可偵檢出。

圖 7 : 分析物的圖譜 (A)UV 圖譜 (B)TNT TIC 圖譜 (C)RDX TIC 圖譜 (D)Phenol TIC 圖譜

圖 8 : 分析物的 SIR 質譜圖 (A)TNT TIC 圖譜(B)RDX TIC 圖譜 (C)Phenol TIC 圖譜

4. 結論

　　液相層析串聯質譜儀是一個較新的儀器設備，一般最常應用於大分子量的分析，尤其是不易揮發或半揮發物質，這是氣相層析質譜儀所無法完成的，本研究以芳香族中結構簡單的酚為例，顯示在低分子量及易揮發特性下，仍能有效偵測及定量，以此類推，對於此型儀器所專長的高分子量及低揮發性特性，其它芳香族化合物將可容易偵測。

　　在 SIR 及 MRM 定量分析時發現，兩者皆可用於精準定量，其中 MRM 模式在樣品辨識上較高，對於樣品基質複雜之樣品，可準確定量待分析物， SIR 模式其偵測能力較佳，對於樣品基質單純者，可在極低濃度下精準定量，這兩種模式可分別應用於工業意外災害分析及地下水污染檢測，其偵測結果，有助於提供災害緊急應變及國土復育之參考。

　　芳香族火炸葯 [17-19] 分析結果顯示此分析技術可有效鑑別火炸藥種類及濃度，可協助國軍部隊靶場芳香族火炸葯污染監測，未來研究可以將常用之毒化物建制圖譜資料庫，建制資料庫可在更短時間內完成毒化物種類辨識及定量，此外也可鑑別污染物經消除後所產生之副產物結構，了解其降解反應機制，確保污染消除效果。

參考文獻

[1] 楊寶旺譯， Robert Thornton Morrison, Robert Neilson Boyd 原著，有機化學第二冊，東華書局。

[2] 環境保護署環署水字第０９２００８４７８６號令修正發布第二條條文，中華民國環保法規資料中心

[3] U.S. Environmental Protection Agency, TOXICOLOGICAL REVIEW PHENOL, Washington D.C. (2000).

[4] Belloli, R., B. Barletta, E. Bolzacchini, S. Meinardi, M. Orlandi and B. Rindone, “Determination of toxic nitrophenols in the atmosphere by high-performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography A., 846, pp.277-281, (1999).

[5] 環保署公告環署檢字第 0910091017 號公告。

[6]J. J. Thomson, “Rays of positive electricity and their application tochemical analysis”, Longmans, London . (1913).

[7]A. O. Nier, “Electron impact mass spectrometry”, Rev Sci Instrum., 415, 18, ( 1947).

[8]M. S. B. Munson; F. H. Field, “Chemical ionization mass spectrometry”, J. Am. Chem. Soc., 88, 2621,(1960).

[9]M. Yamashita,; J. B. Fenn, “Electrospray ion source:Another variation on the Free-jet theme”, J. Phys. Chem., 88, 4451,(1984).

[10]M. Karas,; F. Hillenkamp, “Laser desorption ionization of proteinswith molecular masses exceeding 10000 daltons”, Anal. Chem., 60, 2299, (1988).

[11] 張德有，融合微粒電噴灑游離質譜法的 發展與應用，國立中山大學化學研究所碩士論文 (2000) 。

[12] 林嘉信，高效能液相層析連接融合微滴 電噴灑游離質譜法的發展，國立中山大 學化學研究所碩士論文 (2001) 。

[13] ”Waters ZMD User's Guide”, p45 、73.

[14] TIC (total ion current profile) : 為總離 子流對時間做圖。每一點代表於此單位 時間之全掃瞄 (full scan) 所得總離子 流，在訊號峰的成份及結構鑑定上可提 供更多的証據和參考資料。

[15] 陳景星，發展液相層析串聯式質譜儀 的方法來定量分析雌素酮代謝物，國 立成功大學環境醫學研究所。

[16] 林仁智，動化序列注入分析大氣壓力 化學離子化與電灑質譜法偵測尿液中 嗎啡，立東華大學化學研究所。

[17]Thorsten Reemtsma, ”Liquid chromatography–mass spectrometry and strategies fortrace-level analysis of polar organic pollutants”, Journal of Chromatography A, 1000, 477–501, (2003).

[18]C. S. Evans, R. Sleeman, J. Luke and B. J. Keely, “A rapid and efficient mass spectrometric method for the analysis of explosives”, Rapid Commun Mass Spectrum., 16, 1883-1891, (2002).

[19]Thorsten Reemtsma, “The use of liquid chromatography-atmospheric pressure ionization-mass spectrometry in water analysis Part II: Obstacles”, Trends in analytical chemistry, 20, 10, (2001).